细胞免疫治疗的研究始于20 世纪80 年代,人们陆续研究了淋巴因子激活的杀伤(LAK) 细胞、肿瘤浸润淋巴(TIL) 细胞、CD3 单克隆抗体(简称单抗) 激活的杀伤(CD3AK) 细胞等,体外

研究均具有一定的杀瘤活性,但是由于细胞的扩增倍数低,细胞毒力不强,故其临床应用受到很大的限制。1991 年美国斯坦福大学医学院的Schmidt2Wolf 等[1 ] 报道了具有高增殖能力和高细胞活性的CIK细胞,它是将人外周血或骨髓单个核细胞在体外用多种细胞因子与CD3 单抗共同培养一段时间后获得的一组异质细胞,同时表达CD3 和CD56 ,也称自然杀伤(NK) 细胞样T淋巴细胞,它同时具有T 细胞的抗瘤活性和NK 细胞的非MHC限制性杀瘤特点。CIK细胞是目前恶性血液病细胞免疫治疗中最具前景的细胞之一。

1 　CIK细胞的来源

CIK细胞是人血液或骨髓的单个核细胞在体外经与多种细胞因子和CD3 单抗共同培养获得,其单个核细胞可以有不同的来源,包括白血病患者的骨髓或外周血单个核细胞、健康供者的外周血单个核细胞和脐血单个核细胞。

1. 1 　来源于白血病患者的单个核细胞Christine 等[2 ]从13 名慢性髓细胞性白血病(CML) 患者的外周血单个核细胞中成功扩增出CD3 + CD56 + 的CIK细胞群,培养第21～28 天CD3 + CD56 + 细胞平均扩增25 倍(2. 2～525 倍) ,全部患者的外周血单个核细胞在培养开始时细胞遗传学检测均为Ph( + ) ,培养至第21～28 天,12 名患者Ph( - ) 。他们的研究显示CML 患者CIK扩增倍数低于正常供者,但与淋巴瘤患者CIK扩增倍数相近,CIK扩增的倍数与患者的异质性有关而与培养条件无关,而且与培养起始时CD3 + 或CD3 + CD56 + 数无关,也与以往的治疗无相关性,从高白细胞的患者或原始细胞比例增高的患者中均可培养出Ph ( - ) 的CIK细胞。值得注意的是2 例来自患者冻存外周血的细胞扩增不理想。

1. 2 　来源于正常供者的单个核细胞Schmidt2Wolf 等[3 ] 从正常供者的外周血单个核细胞培养CIK细胞,培养14 d 时CIK细胞的T 细胞受体αPβ阳性,CD3 +CD56 + 的CIK细胞为28. 5 % ,培养前后CIK细胞扩增1 071 倍。Schmidt2Wolf 等的研究显示CIK细胞比LAK细胞的扩增更快,且具有较LAK细胞更强的对肿瘤细胞株的溶细胞活性,CIK介导的细胞溶解作用是非MHC 限制性的。

1. 3 　来源于脐血的单个核细胞黄倩等[4 ]用脐血单个核细胞第1 天加入γ干扰素( IFNOγ) ,第2 天加入白细胞介素O2 ( ILO2) 、CD3 单抗,培养4 d 后获得脐血CIK细胞。脐血CIK细胞对K562 细胞的杀伤活性强于CD3AK,两组的杀伤率分别为76. 85 %、71. 18 %;且脐血CIK胞的培养上清对K562 细胞的杀伤活性也优于CD3AK,两组的杀伤率分别为35. 92 %、29. 05 %。短期培养的脐血CIK细胞的增殖活性低于CD3AK,但加入粒细胞集落刺激因子( GOCSF) 可

显著提高CIK细胞的增殖数量。2 　CIK细胞的制备方法目前诱导CIK细胞的方法有多种,主要区别在于细胞因子的组合不同。CD3 单抗和IFNOγ是必要的组分,CD3 单抗起到丝裂原活性的作用,可以与T 细胞表面的CD3 交联,诱导细胞活化,而IFNOγ可以诱导ILO1 等细胞因子的合成。其他的细胞因子尚有ILO1、ILO2、ILO7、ILO12 等。国内王文红等[5 ] 比较了3 种方法诱导的CIK细胞在细胞表型、增殖活性和细胞毒性3 个方面的异同。用RPMI1640 调整外周血单个核细胞至2 ×106 ·ml - 1 ,第1 天每组均加入重组人IFNOγ至终浓度为1 000 U·ml - 1 ,置37 ℃、体积分数为5 %CO2 细胞培养箱中培养,24 h 后加CD3 单抗25μg·L - 1 ,各组再分别加入重组人白细胞介素:第1 组ILO1 100 U·ml - 1 ,ILO2 300 U·ml - 1 ;第2 组ILO2 300 U·ml - 1 ;第3 组ILO12 100 U·ml - 1 。各组加入以上细胞因子后继续培养,每3～4 d 换新鲜培养液,调整细胞数为2 ×106 ml - 1 ,同时分别补加3 种白细胞介素。于第14 天收集细胞检测。3 组CIK细胞的生物学性状以流式细胞仪检测其CD3、CD4、CD8、CD16、CD56的表达,ILO1和ILO2 联合组CD4 细胞的百分率高于其他两组,LO12 组CD3 细胞的百分率低于其他两组。CIK细胞的增殖能力方面,ILO12 组的略低于其他两组,另外两组间无差异。用LDH释放法测定CIK细胞的细胞毒性,结果显示3 组CIK细胞在杀伤活性上不存在明显差异。结果表明,CIK培养时加入ILO1 不能增加细胞的增殖能力,CIK细胞的诱导方法可以简化,目

前多数实验室均采用IFNOγ、CD3 单抗和ILO2 联合应用制备CIK细胞[2 ] 。CIK细胞应于临床一方面要保证足够的数量,另一方面要保证CIK细胞较强的生物学活性和减少感染的机会。北京大学石永进等[6 ] 在CIK细胞的培养中采用1 000 ml 的大容量培养袋,用一次性注射器进行细胞的定量加样、取样,换液时将培养袋在大容量离心机中离心1 000 r·min- 110 min ,再用分离夹挤出上清,新配好的培养液经输液管插入培养袋进液管后输入培养袋,密封后放入37 ℃恒温箱培养。这种培养方法操作更简单,污染机率大大降低,使回输更安全。

3 　CIK细胞体内、体外的应用研究

CIK细胞的制备技术已相当成熟,其在实体瘤的应用已有陆续报道[7 ] ,但在恶性血液系统疾病的应用较少,多数研究尚在实验室阶段。

3. 1 　CIK在急性髓细胞性白血病的应用研究

新加坡的Linn 等[8 ] 利用急性白血病患者诊断时的单个核细胞扩增出CIK细胞,培养后CD3 + CD56 + 细胞百分率为7. 6 %～65 % (平均35. 3 %) ,这些细胞可以杀死人类NK细胞的靶细

胞K562 细胞。Linn 等观察到该CIK效应细胞能够溶解自体急性单核细胞性白血病(AML) 靶细胞,并且能够产生抗异体白血病原始细胞的细胞毒作用。该研究提示,CIK细胞在AML 的细

胞免疫治疗、AML 的残留病灶、异基因移植后供体淋巴细胞输注和化疗复发的患者具有广泛的应用价值。Linn 等[9 ] 在另一项研究中用正常供者的异体CIK细胞输注给荷白血病的小鼠,

该异体CIK细胞不诱导移植物抗宿主病(GVHD) ,而且可以延长荷瘤小鼠的生存期。该研究同时显示CIK细胞可以与树突状细胞(DC) 相互作用增加细胞的抗瘤活性。

3. 2 　CIK在急性淋巴细胞性白血病的应用研究

北京人民医院张乐萍等[10 ] 临床应用CIK细胞与ILO2 联合治疗儿童急性淋巴细胞白血病(ALL) 微小残留病灶(MRD) 。他们选择28 例化疗12 个月后MRD 仍阳性的儿童ALL 患者,其中14 例为CIK治疗组,另外14 例为对照组。CIK的输注方法为:取培养10 d 的自体CIK细胞,如霉菌、细菌培养阴性,活细胞大于95 % ,分2 d 通过输血器回输给患者,回输CIK的次日起给予ILO2 5 ×105 IU·d - 1 皮下注射,共5～10 d。回输细胞数为(8～27) ×109 。每2 个月进行骨髓形态学、MRD 检测。结果显示,14例应用CIKPILO2 治疗1～4 个疗程,输注过程中无一例出现寒战、发热、过敏,对心肺功能影响不大;输注后外周血白细胞略有升高,血红蛋白和血小板无变化,说明CIK治疗具有安全性。治疗组随访5～33 个月无一例复发,生存时间超过30～54 个月,且骨髓形态学和MRD 检测均为阴性,1 例脾大者也于治疗后回缩。对照组8 例复发死亡,两组复发率比较差异有显著性。

3. 3 　CIK在慢性髓细胞性白血病的应用研究

Scheffold 等[11 ]将CML 患者的外周血淋巴细胞制成CIK细胞,该CIK细胞对自体和异体的CML 肿瘤细胞都有明显的杀伤活性。Christine 等[2 ] 从13 名CML 患者的外周血单个核细胞中扩增出CD3 + CD56 + 的CIK细胞群。其中4 名患者的CIK细胞可以抑制自体CML 原始细胞的克隆生长,该研究同时显示来自正常供者的异体CIK细胞也可以抑制CML 的克隆生长。在培养开始时细胞遗传学检测均为Ph ( + ) ,至培养的第21～28天,12P13 患者Ph( - ) 。这提示恶性细胞在CIK培养的条件下死亡了,它表明Ph( + ) 的前体细胞在理想的培养条件下被净化了。

3. 4 　在其他血液肿瘤中的应用

石永进等[6 ] 应用自体CIK细胞对5 名恶性血液系统肿瘤患者进行治疗,包括多发性骨髓瘤(MM) 2 例、非霍奇金淋巴瘤(NHL) 1 例、早幼粒细胞白血病(APL) 1 例、急性非淋巴细胞白

血病(AML M4) 1 例。自体CIK细胞的回输总量在1. 6 ×1010 以上,分2～3 次回输,回输时患者未出现明显毒副反应,回输后进行心、肝、肾等器官功能检测未出现新的异常。随访22～26

个月,其中APL 患者CIK 治疗前PMLORARα融合基因为阳性,CIK回输后转为阴性,2 年后检查仍为阴性;除AML M4 患者复发外,其他患者均正常,未见复发。

3. 5 　CIK在经过自体移植的白血病患者的应用

Alvarnas 等[12 ] 取25 例经过自体移植的白血病患者的供者干细胞(PBPC) 标本,用常规方法在第21 天培养出CIK细胞,扩增倍数44. 8 倍,在第21 和28 天,其特异性溶瘤作用分别为24 %和42 %。两名AML 患者的CIK细胞对OCIOLY8 的抗瘤作用分别为39 %、78 %。而对自体白血病细胞的溶瘤率分别为26 %、58 %(效靶比40∶1) 。该研究显示经过自体移植的血液病

患者,用GOCSF 动员的外周血单个核细胞可以扩增出CIK 细胞,因此CIK可以成为移植后患者的一种有效的免疫治疗手段。目前有关CIK细胞对靶细胞的杀伤原理还不完全清楚,Bela 等[13 ] 认为CIK对靶细胞的杀伤有两条途径:一是CIK 细胞被淋巴细胞功能相关抗原O1 (LFAO1) 有关识别机构激活,导致胞浆毒性颗粒依赖性的溶细胞作用,这条途径与胞浆内环磷酸腺

苷(cAMP) 浓度无关;二是CIK细胞表面的CD3 样受体被结合而激活CIK细胞产生胞浆毒性粒介导的溶细胞作用,这条途径与胞浆内cAMP 水平有关。CIK细胞因其高增殖活性以及回输时ILO2 的低依赖性,使其成为现阶段细胞免疫治疗中最具应用价值的方法之一。